北京专门治疗白癜风的医院 https://yyk.39.net/bj/zhuanke/89ac7.html靶向扩增子深度测序（TADS）能够对不同的细菌群落进行表征，但TADS在寄生虫群落中的应用进展相对缓慢。最大的障碍是寄生虫的遗传多样性，包括蠕虫、原生动物、节肢动物和一些棘头类。同时，在不扩增宿主DNA的情况下，普遍扩增所有寄生虫的保守位点已被证明具有挑战性。泛真核PCR优先扩增更丰富的宿主DNA，掩盖了TADS后寄生虫衍生的读数。Flaherty（）描述了一种泛寄生TADS方法，该方法涉及扩增仅在脊椎动物中具有限制性位点的真核18SrDNA区域。使用该方法，在使用限制性内切酶进行PCR之前，可以选择性地消化总DNA提取物中的宿主DNA，从而增加在NGS后获得的寄生虫源性读取数。图1原理图从受寄生虫感染的全血中提取的DNA样本含有大量宿主DNA（蓝色）和少量寄生虫DNA（鲜红色）。使用通用引物对该样本进行常规PCR，主要扩增宿主DNA，并产生几乎完全属于宿主的测序读数（图1a）。之前Flaherty等人开发的TADS方法，是在PCR前对宿主DNA的限制性内切酶消化会改变初始样本中宿主与寄生虫DNA的比例，从而允许选择性扩增寄生虫DNA，并导致PCR后寄生虫扩增子的相对数量增加，以及通过NGS检测寄生虫的灵敏度增加（图1b）。本文试图扩大Flaherty等人的观察结果，以开发基于TADS的通用寄生虫诊断试验，LOD足够用于日常使用。第二组泛真核引物，位于前面描述的启动位点的两侧，能够对原始18SrDNA靶点进行巢式PCR扩增。这种两步套式PCR方法有助于在第一次和第二次PCR之间引入二级限制性内切酶消化步骤，减少可扩增宿主衍生DNA的比例质量，同时增加PCR扩增周期数（图1c）。表1本研究所用样本的宿主、来源和原始鉴定方法本研究中使用的大多数人类临床血液样本最初提交给CDC寄生虫病科，以确认寄生虫感染的诊断。诊断后，样品在μL等分液中进行鉴定和冷冻?80°C供以后使用。所所检测的靶标寄生虫有9种顶复门原虫、4种动质体寄生虫和3种丝虫：恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、马来疟原虫、诺氏疟原虫、微小巴贝斯虫、差异巴贝斯虫、邓肯巴贝斯虫、巴贝斯虫分歧样变异体MO1、克鲁兹锥虫（HIV阳性和HIV阴性临床样本）、克鲁兹锥虫（培养）、布氏锥虫、婴儿利什曼原虫、杜氏利什曼原虫、马来丝虫、罗阿丝虫、常现丝虫，以及将NPF（未发现寄生虫的健康血清）作为阴性对照。图2具有双重消化的UPDx可显著减少TADS后恢复的人源性读取数对于模拟的顶复门寄生虫感染血液，使用UPDx检测到的宿主源性读取百分比与原始方法相比，其中7种减少幅度非常显著。但使用这两种方法测试样本时，微小巴贝斯虫感染在恢复的宿主来源DNA读取数变化没有产生显著差异，但仍观察到数值的减少（图2a）；对于动质体，与早期方法相比，在大多数情况下，使用UPDx可观察到宿主来源的读取量有类似的显著减少，但一些临床克鲁兹锥虫感染除外，未观察到显著差异（图2b）。对于由不同种类丝虫引起的三种感染中的每一种，我们的UPDx方法与原始方法之间未观察到显著差异（图2c）。总之，对于大多数受试感染，采用双重消化的巢式PCR（同时进行D1和D2的标本）后，宿主读数的比例显著降低。图3UPDx分析的优化实验概述在1XCutSmart缓冲液中，用10单位的BamHIHF和BsoBI消化分子级水中的ng或25μL纯诺氏疟原虫（黑条）和婴儿疟原虫（灰条）DNA提取物2小时。样品直接转移到PCR2或在PCR2扩增和DNA测序之前清洗。ng与纯消化无显著差异；DNA清理对样本中回收的寄生虫源性读数的最终比例有负面或最小影响（图3a）。用10单位的BamHIHF和BsoBI在1XCutSmart缓冲液中消化25μL洗脱到分子级水（H2O）或洗脱缓冲液（EB）中的纯诺氏疟原虫（黑条）和乳杆菌（灰条）DNA提取物2小时，并直接转移到PCR2进行扩增和测序。洗脱到水中的样品与洗脱缓冲液之间没有观察到显著差异（图3b）。在存在或不存在1XCutSmart缓冲液的情况下，用10单位的BamHIHF和BsoBI消化洗脱缓冲液中的25μL纯诺氏疟原虫（黑条）或婴儿疟原虫（灰条）DNA提取物2小时，并转移至PCR2进行扩增和测序。对于在CutSmart缓冲液存在下消化的样品，观察到明显更高的寄生虫特异性读数，表明更有效地消化宿主DNA（图3c）。采用原始方法或多种条件之一处理洗脱缓冲液中纯恶性疟原虫或婴儿乳杆菌的DNA提取物，包括用10单位PstIHF消化0、15、60、分钟，或隔夜PCR1消化10或15个周期，以及用10单位BamHIHF和BsoBI消化0、15或60分钟（图3d）。然后用PCR2扩增样本并测序。使用15个周期的PCR1以及前PCR1（消化1）和前PCR2（消化2）消化的任何组合（n=1，ND=无消化）可获得最佳结果。图4UPDx的检测限与标准qPCR类似使用原始通用寄生虫检测方法（灰色条带）、仅含DNA酶1的TADS方法（浅色条带）、仅含DNA酶2的TADS方法（中色条带）及同时含DNA酶1和DNA酶2的巢式TADS方法（深色条带）处理全人类血液中恶性疟原虫3D7的一系列稀释液。使用双因素方差分析和Tukey多重比较后测评估条件间差异的统计显著性，p0.，n=3，平均值±SD。同时使用限制性内切酶1和酶2的巢式PCR在样本中检测恶性疟原虫的检测限是0.58个寄生虫μL。用目前CDC常规检测恶性疟原虫的qPCR方法对相同样品进行的分析，表明在0.58和5.8个寄生虫/μL之间观察到阳性扩增曲线。两种方法的检测限及重复性相当，说明本文所建立的方法具有可行性和可靠性。表2UPDx对单个标本中多种寄生虫的阳性检测对于由各种寄生虫单独或组合组成的模拟感染，检测到了所有预期寄生虫。这包括所有主要的人类感染疟原虫物种（单一物种和混合感染），以及疟原虫物种、人类感染动质体（克鲁兹锥虫和布鲁氏锥虫）和丝虫线虫（罗阿罗虫和马来丝虫）的模拟组合。在CDC寄生虫参考诊断实验室在形态学上诊断为自然混合种疟疾感染（恶性疟原虫和马来疟原虫）的临床血液样本中，检测出恶性疟原虫和马来疟原虫呈阳性，如预期（表3）。而UPDx分析的一个局限性是，它不能在物种水平上区分每种寄生虫，也不能在属水平上区分某些分类群；分化程度取决于分类单元。这项工作扩展了之前关于PCR前对宿主DNA进行限制性酶切的益处的观察结果，引入了一些新的修饰，旨在提高TAD在脊椎动物生物基质中的寄生虫检测和寄生虫群落特征描述中的效用。与早期检测相比，这些修改将人类血液寄生虫的检测限提高了约10倍，达到了与常规检测方法qPCR相当的水平，增加了UPDx成为寄生虫常规诊断技术的可能性。目前，疾病控制和预防中心以及纽约州寄生虫病参考实验室正在验证该分析方法的常规使用。随着技术不断发展，包括新的文库准备策略，以减少安装时间和运行成本，UPDx会越来越适合于人体血液中常见寄生虫病原体的常规诊断。点评：1.所开发的检测方法可检测血液中16种寄生虫，且能够应用于大量动物物种中寄生虫的检测，通用性极高；2.UPDx不需要对潜在的病原体进行预判，这对可能难以找到合适的鉴别诊断途径的复杂临床情况很有帮助。
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